Microbiome from total RNA-seq (host depletion + Kraken2/KrakenUniq)

Pipeline de análise de microbioma a partir de RNA-seq tumoral, baseado na estratégia de depleção humana com STAR (pangenoma GRCh38 + T2T-CHM13) seguida de classificação taxonômica com Kraken2 ou KrakenUniq, e quantificação dirigida opcional com Salmon. Adaptado das abordagens de estudos de microbioma intra-tumoral em câncer (ex.: Ge et al. 2025, Sci Transl Med).

Por que este pipeline é diferente

• Ribo-depleção (RNA total), não poly-A: maximiza a fração microbiana.
• Pangenoma humano no índice STAR: GRCh38 + T2T-CHM13. Reads que escapam do GRCh38 (telômeros, centromeros) são capturados pelo CHM13 - equivalente ao "dois passes" de depleção.
• KrakenUniq como alternativa ao Kraken2: conta k-mers únicos por táxon e reduz falsos positivos - o problema central documentado no paper.
• Banco de genomas completos + humano + UniVec_Core: evita que reads humanas residuais ou vetores sejam classificados como bactérias.
• SortMeRNA entre a depleção e o Kraken: ramo rRNA residual.
• Filtros no R baseados no paper: k-mers únicos >= 100, razão reads/k-mer < 10, blacklist de contaminantes ubíquos, normalização pelo total de reads sequenciadas.

Fluxo

FASTQ (ribo-depletion paired-end)
   │ STAR pangenoma (GRCh38 + CHM13)   -> descarta reads humanas
   ▼  [opcional] SortMeRNA             -> remove rRNA residual
   Kraken2 / KrakenUniq                -> report por táxon (k-mers únicos)
   ▼  R: agregar reports, filtrar      -> lista de espécies candidatas
   [opcional] Salmon (dirigido)        -> expressão por espécie -> DESeq2

Uso (rodar na ordem)

# 1. Ambiente conda (uma vez)
bash scripts/01_conda_env.sh

# 2. Estrutura + referências humanas (uma vez) - ~50 GB
bash scripts/02_refs_human.sh

# 3. Índice STAR pangenoma (uma vez, PBS, ~48h)
bash scripts/03_star_index.sh
qsub -q CCAD_Q1 ~/rnaseq_microbiome/run/pbs/star_index.pbs

# 4. Banco de classificação (uma vez)
bash scripts/04_kraken2_db.sh          # Kraken2 PlusPF (mais simples)
bash scripts/06_krakenuniq_db.sh       # KrakenUniq (k-mers únicos, ~200-500 GB)

# 5. Lista de amostras (sample<TAB>R1<TAB>R2; sem CRLF; header na linha 1)
#    e ajustar #PBS -J 2-<N+1> nos scripts ao nº real de amostras
cp -a /caminho/para/sua_lista.tsv ~/rnaseq_microbiome/run/lists/samples.tsv
sed -i 's/\r$//' ~/rnaseq_microbiome/run/lists/samples.tsv

# 6. Pipeline principal (1 job por amostra, PBS array)
bash scripts/05_main_kraken2.sh        # STAR + Kraken2
# ou
bash scripts/07_main_krakenuniq.sh     # STAR + SortMeRNA + KrakenUniq

# 7. (Opcional) Quantificação dirigida por espécie
bash scripts/08_salmon_index.sh        # baixa transcriptomas + índice
bash scripts/09_salmon_quant.sh        # PBS array

# 8. Agregar e filtrar no R
Rscript scripts/10_analyze_reports.R

Parâmetros principais

Parâmetro	Valor	Por quê
STAR --outFilterMismatchNmax	3	mais stringente que default (10): reads humanas com SNPs não escapam
STAR --sjdbOverhang	149	150-1 (comprimento do read)
KrakenUniq --hll-precision	12	precisão do estimador de cardinalidade de k-mers
KrakenUniq --kmer-len / --minimizer-len	31 / 15	defaults recomendados
SortMeRNA	-	remove rRNA antes da classificação

Estrutura

microbioma_rnaseq/
  scripts/
    01_conda_env.sh          # ambiente conda (kraken2, krakenuniq, star...)
    02_refs_human.sh         # GRCh38 + T2T, pangenoma combinado
    03_star_index.sh         # PBS: índice STAR pangenoma
    04_kraken2_db.sh         # download banco Kraken2 PlusPF
    05_main_kraken2.sh       # PBS array: STAR + Kraken2
    06_krakenuniq_db.sh      # construção banco KrakenUniq (genomas completos)
    07_main_krakenuniq.sh    # PBS array: STAR + SortMeRNA + KrakenUniq
    08_salmon_index.sh       # transcriptomas bacterianos + índice Salmon
    09_salmon_quant.sh       # PBS array: quantificação Salmon dirigida
    10_analyze_reports.R     # agrega reports + filtros do paper

Ferramentas

STAR, Kraken2/KrakenUniq, SortMeRNA, Salmon, samtools, pigz, parallel, R (tidyverse).

Referências

• Ge et al. 2025, Sci Transl Med - microbioma intra-tumoral em RNA-seq (paper base)
• Kraken2 + bancos
• KrakenUniq
• SortMeRNA
• STAR
• Salmon